Drugi budynek muzealny przebudowany z dawnego pawilonu barokowego według projektu architekta Chrystiana Piotra Aignera. Został otwarty w 1809 roku z okazji wizyty wojsk polskich księcia Józefa Poniatowskiego w Puławach. Księżna Czartoryska zgromadziła w nim bogaty zbiór pamiątek zagranicznych, przysyłany i przywożony z licznych podróży po Europie (rzemiosło artystyczne, militaria i malarstwo). Dom Gotycki mieścił także zbiory polskie, gdyż bez nich księżnej Czartoryskiej budynek wydawał się czczy i mało znaczący.
Eksponowane były tu m.in.: Dama z gronostajem Leonardo da Vinci, Krajobraz z miłosiernym Samarytaninem Rembrandta van Rjin, a także Portret młodzieńca Rafaela Santi. Wśród dość różnorodnej ekspozycji swoje miejsce znalazły także eksponaty o charakterze typowo sentymentalnym, jak: krzesło Szekspira, sucharek Napoleona Bonaparte, puszka z relikwiami Abelarda i Heloizy, czy kamienie z grobu Romea i Julii. Przechowywano tu również, filiżankę Kara Mustafy, kordelas Jamesa Cooka, rękopisy i dzieła literackie.
Budynek został zaplanowany tak, by ekspozycja umieszczona została nie tylko wewnątrz, lecz także na zewnątrz. I tak oto w dziewięć ścian obiektu, które mają odpowiednio swoją nazwę (Długosza, Kazimierza Wielkiego, Litewska, Żółkiewskiego, Boguty i Sędziwoja, Rzymska, Gostyńska, Kościuszki, Cyda i Chimeny) wmurowano lapidaria przywiezione z różnych zakątków Polski i Europy. Były to m.in. kule z pól bitewnych, płaskorzeźby, fragmenty warownych twierdz, wazy. Na jednej ze ścian umieszczono również tablicę fundacyjną: Elżbieta Czartoryska MDCCCIX, a w ścianę Kazimierza Wielkiego wmurowano sentencję zaczerpniętą z Eneidy Wergiliusza określającą ideę kolekcjonowania pamiątek: I pamiątki łzy wyciskają i znikome rzeczy duszę rozczulają.
Podstawowy trzon Domu Gotyckiego stanowi owalna sala pierwszego i drugiego piętra. Parter składa się z przedpokoju oraz sali zwanej Salą pod Herbami. Niegdyś jej ściany zdobiły herby znamienitych polskich rodów. Kręte schody klatki schodowej prowadzą na pierwsze piętro. Jego ozdobą jest Pokój Zielony zawdzięczający swoją nazwę obiciu ścian. Zdobią go stylizowane fryzy stiukowe; na uwagę zasługuje intarsjowana posadzka oraz kopia kominka pochodzącego z pałacyku Marynki (oryginalny zaginął w czasie II Wojny Światowej). Pięknie prezentuje się także dekoracyjna balustrada łącząca dwie korynckie kolumny. W głębi znajduje się tzw. Pokój malinowy zwany gabinetem, w którym księżna opracowywała zbiory.
